Revista Societatii de Medicina Interna

Articolul face parte din revista :
  Nr.4 din luna 2012

Descarca varianta pdf

Autor

Marilena Stoian, Victor Stoica

Titlu articol

ANEUPLOIDIA, INDICATOR AL DIAGNOSTICULUI PRECOCE DE MALIGNIZARE A ADENOAMELOR COLORECTALE

Cuvinte cheie

adenoame colorectale, aneuploidie, citometrie de flux, carcinoame colorectale, ciclu celular.

Articol

Marilena Stoian1, Victor Stoica2
1Medic primar de medicină internă, asistent universitar, doctor în medicină, Spitalul Clinic "Dr. I Cantacuzino", Universitatea de Medicină și Farmacie "Carol Davila", București
2Medic primar de medicină internă și gastroenterologie, profesor universitar, doctor în medicină, Spitalul Clinic "Dr. I Cantacuzino", Universitatea de Medicină și Farmacie "Carol Davila", București
Adresa decorespondență: Marilena Stoian, Clinica de Medicină Internă, Spitalul Clinic "Dr. I Cantacuzino", strada Ion Movilă nr. 5-7, sector 2, București
e-mail: marilenastoian@yahoo.com
 

 

Introducere

Polipii recto-colonici sunt, adeseori, asociaţi cu leziuni focale neoplazice, fiind rezecaţi endoscopic ca leziuni precanceroase. Mărimea, gradul displaziei şi tipul histologic al polipilor sunt factori de risc pentru transformarea malignă a adenoamelor colorectale. Biologia moleculară a adăugat la lista factorilor de prognostic defavorabil al adenoamelor colorectale şi aneuploidia ADN.
Sunt citate studii în literatură(1,2) în care, cercetându-se conţinutul de ADN din leziunile precanceroase cum ar fi colita ulcerativă cu evoluţie îndelungată sau esofagul Barrett, s-a desprins concluzia că aneuploidia ADN poate fi un marker al transformării maligne a acestor leziuni (figura nr. 1). Studiul analizei conţinutului celular de ADN prin citometrie de flux aplicat unui lot de 50 de pacienţi cu adenoame colorectale şi-a propus să răspundă la întrebarea: poate fi aneuploidia ADN un indicator important în diagnosticul precoce al transformării maligne a polipilor colorectali?

Figura nr. 1. Distribuţia populaţiilor celulare aneuploide la pacienţii cu colită ulcerativă (A), comparativ cu pacienţii cu displazie şi cancer colorectal (B): 2N - populaţie celulară normală; 3,1N şi 3,7N - populaţii celulare aneuploide; 4N - tetraploidie tumorală (după Levine, D.S., Rabinovitch, P.S., Haggitt, R.C. & al, Distribution of aneuploid cell population în ulcerative colitis with dysplasia or cancer. Gastroenterology, 1991; 101: 1198).

Material și metodă

S-a studiat un lot de 50 de polipi colorectali, obţinuţi prin polipectomie endoscopică de la 46 de pacienţi cu vârste cuprinse între 30-80 de ani, cu media de vârstă de 60 de ani. Au fost incluşi în studiu polipii benigni şi polipii cu leziuni focale neoplazice.
Pacienţii şi-au dat consimţământul de a fi examinaţi clinic, endoscopiaţi şi polipectomizaţi, de a răspunde la întrebările cuprinse în fişa de studiu. Datele luate în studiu au fost înregistrate în fişe care au fost validate prin completarea lor de către cei 46 de pacienţi incluşi în studiu.
Pentru a evalua semnificaţia aneuploidiei ADN în transformarea malignă a adenoamelor colo-rectale, au fost analizate separat conţinuturile nucleare de ADN din adenoame şi din regiunile focale canceroase ale polipilor colorectali. Pentru a analiza conţinutul ADN din adenoame şi regiunile carcinomatoase intrapolipoidale, s-a folosit următoarea tehnică: polipii rezecaţi endoscopic au fost secţionaţi vertical în 2 jumătăţi; din prima jumătate s-au secţionat 5 mm şi s-au îngheţat la -70o şi s-au supus imediat analizei citometriei de flux. Restul materialului a fost fixat cu formaldehidă şi a fost inclus în parafină pentru examinarea histologică. Din fragmentul supus îngheţării, s-au identificat prin examinare histologică, zone strict adenomatoase care au fost separate prin secţionare de zonele carcinomatoase, ambele zone fiind supuse separat analizei conţinutului de ADN nuclear.
Analiza histologică a evidenţiat polipi cu diametrul între 1-5 cm, cu grade de displazie diferită, de la grad redus la cel înalt, identificându-se polipi de tip tubular, tubulo-vilos şi vilos.

Analiza citometrică de flux a lotului

Achiziţia şi prelucrarea probelor a fost făcută cu ajutorul unui aparat FACScan (Becton-Dickinson), în programul FACScan, iar analiza datelor s-a efectuat cu ajutorul programului WinMDI 2.8, sub îndrumarea biologilor și tehnicienilor din cadrul Institutului Național de Virusologie București.
Programul FACScan permite reglarea citometrului, achiziţionarea datelor, precum şi sortarea celulelor. Rezultatele achiziţionării sunt prezentate sub formă de grafice bidimensionale dot-plot, în care fiecare celulă este reprezentată printr-un punct situat pe grafic, în funcţie de intensitatea parametrilor reprezentaţi pe axe (FSC, SSC, FL-1 sau FL-2). Pe un astfel de grafic, obţinut prin citirea tubului conţinând celule netratate cu fluorocrom, în care celulele sunt plasate în funcţie de mărime (exprimate în funcţie de intensitatea FSC) şi granularitate (exprimate în funcţie de intensitatea SSC), se trasează poarta pe celulele ce urmează a fi investigate.

 

Figura nr. 2. Estimarea fazelor ciclului celular, la un fragment polipozic din lotul studiat cu ajutorul programului RFIT

Pe un dot-plot în funcţie de FL-1 (axa x) şi FL-2 (axa y), acestea se vor grupa într-o poziţie corespunzătoare unui minim de intensitate a emisiilor fluorescente. După trasarea acestei porţi logice, vor fi achiziţionate numai datele privind fluorescenţa (FL1 şi FL2), rezultată prin cuplarea anticorpilor marcaţi de antigenele de interes. Informaţiile obţinute prin citirea fiecărui tub sunt înregistrate în memorie, urmând a fi folosite în momentul analizei. Graficul se împarte apoi, cu ajutorul a două drepte perpendiculare, în 4 cadrane notate în ordine de la stânga la dreapta şi de sus în jos cu 1, 2, 3 şi 4; criteriul de poziţionare a dreptelor este ca în cadranul 3 să fie cuprins în totalitate controlul negativ. În cadranul 1 se vor grupa celulele care au legat anticorpul marcat cu IP, dar nu pe cel cu ITCF (FL-1-/FL-2+); în cadranul 2, celulele care au legat ambii anticorpi (FL-1+/FL-2+); în cadranul 3, celule dublu negative (FL-1-/FL-2-), iar în cadranul 4 celule FL-1+/FL-2-. Programul calculează apoi automat procentul evenimentelor din fiecare cadran(1)(figura nr. 2).

Rezultate

Dintre cei 50 de polipi, doar 20 de adenoame aveau leziuni focale carcinomatoase intrapolipoidale. Au fost analizate prin metoda citometriei de flux 69 de secţiuni histologice (50 de formaţiuni adenomatoase şi 19 secţiuni cu transformare carcinomatoasă). Aneuploidia a fost remarcată la 11 dintre cazurile studiate, iar tetraploidia doar la unul singur. Indexul ADN în histograme a fost de 1,1, iar procentul celular cu aneuploidie a variat între 5% şi 79% (media 35%) (tabelul 1).
În zonele strict adenomatoase ale polipilor studiaţi, diploidia a fost înregistrată în 43 de cazuri (figura nr. 3), în timp ce aneuploidia doar la 7. Douăsprezece dintre cei 43 de polipi (28%) cu diploidie şi toţi cei 7 polipi cu aneuploidie au prezentat focare concomitente de cancer (tabelul 2).

Tabelul 1. Indexul ADN la adenoame versus carcinoame polipoide colorectale
 

Adenoamele cu aneuploidie au fost asociate cu leziuni focale canceroase într-o proporţie mai mare decât cele cu diploidie (P <0,01).
Studiul fazelor ciclului celular la fragmentele polipozice din lotul de subiecţi a evidenţiat atât populaţii diploide şi aneuploide, cât şi populaţii celulare hipodiploide (figurile nr. 6, 7, 8, 9 și 10).

Tabelul 2: Ploidia ADN la adenoame versus carcinoame

(P <0,01)

Peak G0/1 – 245                                                          Peak G2/M – 490

Figura 3A                                                                     Figura 3B

Figura 3C. Fragment histologic de polip adenomatos colonic vilos (40X; H-E)

Figura 3D Fragment histologic al polipului adenomatos colonic vilos malignizat cu zone de displazie severă (200X; H-E)
Figura nr. 3. Distribuţia populaţiilor celulare diploide (A, B), la fragment polipozic adenomatos (C) şi carcinomatos (D)

Peak G0/1 – 277; 316; 437                                                   Peak G0/1 – 277; 316

Indexul ADN (DI) – 1,1 şi 1,6 la fragment polipozic adenomatos
Indexul ADN (DI) – 1,1 la fragment polipozic carcinomatos
 

Figura 4A

Figura 4B

Figura 4C. Fragment histologic de polip adenomatos tubular sigmoidian, cu displazie epitelială moderată și metaplazie cu celule Paneth (200X; H-E)
Figura 4D. Detaliu - cuiburi de celule atipice infiltrând muscularis mucosae (400X; H-E)
Figura nr. 4. Distribuţia populaţiilor celulare aneuploide la fragment polipozic adenomatos (C) şi carcinomatos (D)

Peak G0/1 – 277; 316; 437                                                    Peak G0/1 – 277; 316

Indexul ADN (DI) – 1,5 numai în fragmentul polipozic adenomatos

Figura 5A

Figura 5B

Figura 5C. Fragment histologic de polip adenomatos mixt tubulo-vilos (100X; H-E)
Figura 5D. Fragment histologic al polipului adenomatos mixt tubulo-vilos malignizat, cu zone de invazie în muscularis mucosae (100X; H-E)
Figura nr. 5. Distribuţia populaţiilor celulare aneuploide (A) la fragment polipozic adenomatos (C) şi diploide (B) la un fragment polipozic carcinomatos (D).

Figura nr. 6. Estimarea fazelor ciclului celular, la un fragment polipozic din lotul studiat cu ajutorul programului RFIT

Figura nr. 7. Distribuţia populaţiei celulare hipodiploide

70 – apariţia unui mic umăr hipodiploid
Figura nr. 8. Distribuţia populaţiilor celulare hipodiploide la fragment polipozic adenomatos

Figura nr. 9. Distribuţia populaţiilor celulare hipodiploide la fragment polipozic adenomatos

Figura nr. 10. Distribuţia evenimentelor apoptotice la fragmente polipozice adenomatoase din lotul studiat

În porţiunea neoplazică a celor 19 polipi cu leziuni focale carcinomatoase, aneuploidia a fost prezentă la 10 polipi (tabelul 1, cazurile 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11). Într-o proporţie de 60% (la 6 dintre aceşti 10 polipi), aneuploidia a fost prezentă şi în porţiunea adenomatoasă (tabelul 1, cazurile 1, 2, 3, 4, 5, 6).
Indexul ADN (DI) din porţiunea adenomatoasă a fost similar celui calculat din porţiunea carcinomatoasă. În cazul 7, aneuploidia a fost prezentă în regiunea adenomatoasă, în timp ce regiunea carcinomatoasă înregistrează diploidie (figura nr. 5). În cazul 2, regiunea adenomatoasă a prezentat poliploidie, cu un singur peak aneuploidal, înregistrat în zona carcinomatoasă (figura nr. 4).
Următorul pas al studiului l-a constituit analiza aneuploidiei şi relaţia acesteia cu factorii de risc carcinogenetic al polipilor colorectali (tabelul 3).

Tabelul 3. Ploidia ADN şi factorii de risc carcinogenetic ai polipilor colo-rectali

           (P < 0,05)

Aneuploidia nu a fost prezentă în niciunul dintre polipii mai mici de 1 cm. A fost înregistrată în 4 cazuri din cei 20 de polipi cu dimensiuni între 1-2 cm şi în 3 cazuri din cei 8 polipi cu diametru mai mare de 2 cm. Aceste diferenţe au semnificaţie statistică P <0,05.
Aneuploidia prezentă în regiunea adenomatoasă tinde să fie mai puţin prezentă în polipii cu grad redus de displazie (12%), decât la polipii cu grad înalt de displazie (22%), fără a avea semnificaţie statistică. Nu s-a înregistrat nicio corelaţie statistic semnificativă între gradul de ploidie ADN şi tipul histologic adenomatos.

Discuții și concluzii

Studiul prezentat a evidenţiat frecvenţa diferită a aneuplodiei la adenoame versus carcinoame: aneupoidia este mai frecventă în porţiunile cu transformare carcinomatoasă, în comparaţie cu regiunile strict adenomatoase polipozice.
Frecvenţa aneuploidiei la polipii adenomatoşi colorectali a fost corelată cu mărimea polipilor, unul dintre factorii de risc convenţionali ai carcinogenzei adenomatoase polipozice colorectale. Rezultatele sugerează că aneuploidia este un indicator precoce al transfomării maligne a adenoamelor în adenocarcinoame polipozice colorectale.
Studiul a evidenţiat faptul că în polipii cu leziuni focale neoplazice maligne, există index ADN similar în porţiunea carcinomatoasă, comparativ cu regiunea strict adenomatoasă. Acest rezultat sugerează faptul că aneuploidia este deja prezentă în stadiul strict adenomatos, iar celulele neoplazice iau naştere din clonele celulare adenomatoase cu aneuploidie. Afirmaţia susţine, astfel, conceptul filiaţiei polip-cancer, concept intens dezbătut şi dezvoltat de cercetători. Studiile lui Vogelstein şi ale colaboratorilor pe tema polipozei familiale adenomatoase arată că transformarea malignă a adenoamelor colorectale este un proces multistadial, cu alterări mutaţionale genice, prezente încă din stadiul adenomatos.
Schackney şi colaboratorii sugerează faptul că activarea mutaţională a unor oncogene induce producerea unui peak aneuploidal(3), iar Burner şi colab. au arătat că mutaţiile proto-oncogenei K-ras preced alterări ale statusului ploidal în procesul de evoluţie şi dezvoltare carcinomatoasă(4).
Alte studii din literatură(5) indică faptul că aneuploidia se corelează cu frecvenţa mutaţiilor K-ras şi pierdere alelică a cromozomului 17p. Aneuploidia prezentă în porţiunea strict adenomatoasă polipozică reflectă aceste modificări genetice, modificări care sunt prezente încă din acest stadiu precoce precarcinogenetic.
În studiul prezentat, aneuploidia a fost corelată cu mărimea polipului, fiind în concordanţă cu rezultatul altor studii descrise în literatură. Studiul a evidenţiat că modificările de ploidie au fost mai frecvente la polipii cu dimensiuni între 1-2 cm, rezultatul fiind în concordanţă cu alte studii care descriu alterări genetice K-ras cu frecvenţă crescută la adenoame de 1-2 cm diametru(6).
Concluzia imediat desprinsă este aceea că în polipii cu diametrul între 1 şi 2 cm apar modificări genetice importante. Transformarea ireversibilă a adenomului polipozic colorectal în adenocarcinom intrinsec genomului necesită intervenţia unui anumit factor de mediu.

Bibliografie

1. Hammarberg C., Slezak P., Trihekart B.,  Early detection of malignancy in ulcerative colitis: a flow-cytometric DNA Study, Cancer, 1994; 53: 291 ÷ 295
2. Levine D.S., Rahnovitch P.S., Haggit R.C., Blount P.L., Dean P.Y., Rubin C.E. Distribution of aneuploid cell populations in ulcerative colitis with dysplasia or cancer, Gastroenterology, 2009; 101: 1198 ÷ 1210
3. Shackney S.E., Smith C.A., Miller B.W., Model for genetic evolution of Human solid tumor. Cancer Res. 2009; 49: 3344 ÷ 3354
4. Burner G.C., Rabinovitch P.S., Laeb L.A.,  Analysis of C-Ki-ras mutation in human colon carcinoma by cell sorting, polymerase chain reaction, and DNA sequencing, Cancer Res. 1999; 49: 2141 ÷ 2146
5. Suchy B., Zeitz C., Rahes M.M. K-ras point mutations in human colorectal carcinomas: relation to aneuploide and metastasis. Int. J. Cancer, 2002; 52: 30 ÷ 33
6. Macral F.A., and Williams C.B. A prospective colonoscopic follow-up study of 500 adenome patients with multivariate analysis to predict risk of subsequent colorectal tremours, Gastroenterology, Endosc., 1992; 28: 138